（注意：以下举例为常规qPCR 反应体系和反应程序，实际操作中应根据模板、引物结构和目的 片段大小不同进行相应的改进和优化） 1. 将DNA模板、引物、2×SYBR qPCR Mix、50 × ROX Reference Dye I/II溶解并置于 冰上备用。 2. 根据以下表格配置反应体系，总体积为20 μl。试剂用量终浓度2 ×SYBR qPCR Mix10 μl1 ×正义引物 (10 μM)0.5 μl0.25 μM反义引物 (10 μM)0.5 μl0.25 μM模板DNAx μl50× ROX Reference Dye I or II0.4 μl1 ×ddH2OUp to 20 μl（注意：a.通常引物浓度以 0.25 μM 可以得到较好结果，可以终浓度 0.1-1.0 μM 作为设定范围的参 考。扩增效率不高的情况下，可提高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化 反应体系；b.通常 DNA 模板的量以 10-100 ng 基因组 DNA 或 1-10 ng cDNA 为参照，因不同物种的 模板中含有的目的基因拷贝数不同，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。)需使用 ROX Reference Dye I 的机型：ABI Prism5700、7000、7300、7700、7900、7900HT、 7900HT Fast、Step-One、Step-One Plus。 需使用 ROX Reference Dye II 的机型： ABI Prism 7500/7500Fast 、 ViiA7, QuantStudio3/5/6Flex/7Flex, Stratagene MX4000/MX3005P/MX300...
1. 易错PCR体系推荐反应体系（30 μl）试剂用量模板DNA10-100 ngPrimer F (10 μM)1 μlPrimer R (10 μM)1 μl2× Error Prone PCR Mix15 μl10× MnCl23 μlddH2OUp to 30 μl2. 易错PCR程序 按用户已经优化的PCR条件进行一定循环数的PCR，如果没有优化的PCR条件，可 先尝试下面的PCR程序。过程温度时间预变性94℃3 min30-60 cycles变性94℃30 sec退火45℃30 sec延伸72℃1 min/kb3. 结果检测：反应结束后取5 μl反应产物，加入适量上样缓冲液，然后进行琼脂糖凝 胶电泳，检测是否得到预期片段大小的PCR产物。4. 胶回收易错PCR扩增产物、克隆并对单菌落进行功能筛选或测序分析、如果需要增 加突变率，可以突变后的DNA为模板，进行连续易错PCR。
1. 没有RNA产物。 最常见原因是模板有RNase污染，可用纯化好的RNA跟模板DNA一起保温再电泳， 再检测其是否有污染。 2. RNA产量低。 最常见的原因是DNA模板。在转录序列的第一个和第二个碱基最好都是G，在前14 个碱基内避免有U存在。 3. RNA长度比预期的短。 可能是模板序列中有T7 RNA聚合酶的终止序列。 4. RNA长度比预计的长。 T7 RNA聚合酶跟Taq DNA聚合酶一样，有不依赖于模板的加尾功能，最多有一半 的RNA可以带一个或两个碱基的尾巴。如果RNA长度比预计的长很多，使用的模板 又是 质粒DNA，则可能是质粒线性化不彻底。5. 5′单磷酸还是三磷酸? 如果使用GTP，则得到的RNA是三磷酸，体外转录时如果保温时间太长（如12小 时），则有50%的三磷酸会变成单磷酸。如果在转录体系中加入GMP，则T7 RNA聚 合 酶将优先使用GMP，所得RNA产物中5'端是单磷酸的比例将大大增加。 6. 用体外转录试剂盒如何得到带帽RNA? 需加入带帽NTP类似物即可。
1. 在 1.5ml 离心管中加入 100 μl 溶液 A。 2. 将 3-10 mg 植物叶片直接加到溶液 A 中，用枪头捣碎。如果样品为种子，则将种子敲 碎，然后取一碎片（约 1/4 豌豆大小）进行后续实验步骤。 3. 95℃孵育 10 min，对于比较难裂解的样品，适当延长保温时间至 15-30 min。 4. 加入 100 μl 溶液 B，简短振荡混匀后可直接取上清为模板进行 PCR 扩增。（注：裂解液体积不要超过反应体积的 1/10，建议做梯度稀释测试以确定最佳反应体系。本产品提取 的 DNA 不能用电泳检测方法检测，只能用作扩增模板）
一、液体样品1. 将约 2 μL 液体样品（如全血、细胞培养液、病毒样品、粪便样品）加入到 50 μL 免 提取核酸释放剂中。 （注意：总液体样品用量不要超过本产品用量的 1/10。） 2. 室温放置 3 分钟；对于较难裂解的样品（如有厚壁的真菌等），则保温时间可以延长 到 10-30 分钟。 3. 简短振荡混匀后取样品裂解液直接进行 PCR 扩增或其他扩增。（注：裂解液体积最好不要超过反应体积的 1/10，对 50μL 的扩增体系，加入的裂解液不要超过5μL。由于不同的扩增体系成分不同，建议做梯度测试以确定最佳反应体系）二、组织样品 1. 将或 2 mg 的固体样品（如动物组织、植物叶片、种子等）加入到 50 μL 免提取核酸 释放剂中。（注意：总样品量不要超过 1 mg/10 μL 的比例。） 2. 95℃加热 5 分钟；对于较难裂解的样品（如石蜡组织切片、血斑等），则保温时间可 以延长到 10-30 分钟。 3. 简短振荡混匀后取样品裂解液直接进行 PCR 扩增或其他扩增。（注：裂解液体积最好不要超过反应体积的 1/10，对 50μL 的扩增体系，加入的裂解液不要超过 5μL。由于不同的扩增体系成分不同，建议做梯度测试以确定最佳反应体系）