1. 易错PCR体系推荐反应体系(30 μl)试剂用量模板DNA10-100 ngPrimer F (10 μM)1 μlPrimer R (10 μM)1 μl2× Error Prone PCR Mix15 μl10× MnCl23 μlddH2OUp to 30 μl2. 易错PCR程序 按用户已经优化的PCR条件进行一定循环数的PCR,如果没有优化的PCR条件,可 先尝试下面的PCR程序。过程温度时间预变性94℃3 min30-60 cycles变性94℃30 sec退火45℃30 sec延伸72℃1 min/kb3. 结果检测:反应结束后取5 μl反应产物,加入适量上样缓冲液,然后进行琼脂糖凝 胶电泳,检测是否得到预期片段大小的PCR产物。4. 胶回收易错PCR扩增产物、克隆并对单菌落进行功能筛选或测序分析、如果需要增 加突变率,可以突变后的DNA为模板,进行连续易错PCR。
1、缓冲液 FP1 可能会发黄,并不影响提取效果。若 Buffer QP1 或 Buffer QP2 有沉淀析出, 可在 37℃水浴溶解,摇匀后使用; 2、 所有离心步骤均为使用台式离心机,室温下离心;3、 样品应避免反复冻融,否则会导致提取的 DNA 片段较小且提取量也下降。
(注意:使用前在 BufferGP1 中加入β-巯基乙醇,使其终浓度为 0.2%,水浴锅中 65°C 预热) 1. 取植物新鲜组织约 100 mg 或干组织约 30 mg,加入液氮充分研磨。 (注意:如果组织为较幼嫩部分,可不用液氮研磨,直接在研钵中加入 700 μl Buffer GP1 和组织一起研磨即可) 2. 将研磨后的粉末收集到一离心管(自备)中,加入 700 ul 65℃预热的 Buffer GP1(使 用前在预热的 Buffer GP1 中加入β-巯基乙醇,使其终浓度为 0.2%),迅速颠倒混匀或用涡旋 振荡器充分振荡混匀,然后将离心管置于 65°C 水浴 20 min,期间每隔 3 - 5 min 颠倒 离心管混匀样品一次。 (注意:如要去除 RNA,可在上述步骤完成后加入浓度为 100mg/ml 的 RNaseA 4 μl,振荡混匀,室 温处理 5-10min)3. 加入 700 μl 氯仿,充分混匀,12,000 rpm 离心 5 min。 (注意:如果提取的植物材料富含多酚或淀粉,可在第 3 步骤前用酚:氯仿/1:1 进行等体积抽提) 4. 小心将上层水相转入一新的离心管(自备)中,加入 700 μl Buffer GP2,充分混匀。 将混匀后的溶液转入离心吸附柱中,若一次不能转移完成,可分次加入,12,000 rpm 离心 30 sec,弃收集管中废液。 5. 向吸附柱内加入 500 μl 的 Buffer W1,室温 12,000 rpm 离心 30 sec,弃收集管中废液。 (注意:Buffer W1 是浓缩液,按要求加入乙醇,用后及时盖紧,以防乙醇挥发)6. 向吸附柱内加入 500 μl 的 Buffer W2,室温 12,000 rpm 离心 ...
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应用领域:适用于基因组学、蛋白质组学、细胞组学、免疫检测、代谢组学、生物制药研究与开发以及其他常用的高通量移液过程。