（注意：以下举例为常规qPCR 反应体系和反应程序，实际操作中应根据模板、引物结构和目的 片段大小不同进行相应的改进和优化）
1. 根据以下表格配置反应体系，总体积为20 μl
试剂 | 用量 | 终浓度 |
2 × Probe qPCR Master Mix | 10 μl | 1 × |
正义引物 (10 μM) | 0.5 μl | 0.25 μM |
反义引物 (10 μM) | 0.5 μl | 0.25 μM |
探针(10 μM) | 0.5 μl | 0.25 μM |
50× ROX Reference Dye I or II | 0.4 μl | 1 × |
模板DNA | x μl |
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DEPC-ddH2O | Up to 20 μl |
|
注意：
1）通常引物浓度以 0.25 μM 可以得到较好结果，可以在 0.1 ~ 1.0 μM 作为设定范围的参考。
2）使用的探针浓度，与使用的荧光定量 PCR 仪、探针种类、荧光标记物质种类有关，实际使用时 请参照仪器说明书，或各荧光探针的具体使用要求进行浓度的调节。
3）通常 DNA 模板的量以 10-100 ng 基因组 DNA 或 1-10 ng cDNA 为参照，因不同物种的模板中含 有的目的基因拷贝数不同，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。
需使用 ROX Reference Dye I 的机型：ABI Prism5700、7000、7300、7700、7900、7900HT、 7900HT Fast、Step-One、Step-One Plus。 需使用 ROX Reference Dye II 的机型：ABI Prism 7500/7500Fast、ViiA7, Stratagene MX4000/MX3005P/MX3000P。
不需要使用 ROX 的机型：Bio-Rad CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4; Cepheid SmartCycler; Eppendorf Mastercycler ep realplex, realplex 2 s; Illumina Eco qPCR; Qiagen/Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000; Roche Applied Science LightCycler 480; Thermo Scientific PikoReal Cycler。
2. qPCR 反应程序，两步法 PCR：
过程 | 温度 | 时间 |
预变性 | 95℃ | 5 min |
35 ~ 40 cycles | 变性 | 95℃ | 15 sec |
退火/延伸 | 60℃ | 30 sec |
（注意：建议采用两步法PCR反应程序，若因使用Tm值较低的引物等原因，得不到良好的实验结果时，可尝试进行三步法PCR扩增，退火温度请以55℃ - 65℃的范围作为设定参考）
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