（注意：以下举例为常规qPCR 反应体系和反应程序，实际操作中应根据模板、引物结构和目的 片段大小不同进行相应的改进和优化）
1. 将DNA模板、引物、2×SYBR qPCR Mix、50 × ROX Reference Dye I/II溶解并置于 冰上备用。
2. 根据以下表格配置反应体系，总体积为20 μl。
试剂 | 用量 | 终浓度 |
2 ×SYBR qPCR Mix | 10 μl | 1 × |
正义引物 (10 μM) | 0.5 μl | 0.25 μM |
反义引物 (10 μM) | 0.5 μl | 0.25 μM |
模板DNA | x μl |
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50× ROX Reference Dye I or II | 0.4 μl | 1 × |
ddH2O | Up to 20 μl |
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（注意：a.通常引物浓度以 0.25 μM 可以得到较好结果，可以终浓度 0.1-1.0 μM 作为设定范围的参 考。扩增效率不高的情况下，可提高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化 反应体系；b.通常 DNA 模板的量以 10-100 ng 基因组 DNA 或 1-10 ng cDNA 为参照，因不同物种的 模板中含有的目的基因拷贝数不同，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。)
需使用 ROX Reference Dye I 的机型：ABI Prism5700、7000、7300、7700、7900、7900HT、 7900HT Fast、Step-One、Step-One Plus。
需使用 ROX Reference Dye II 的机型： ABI Prism 7500/7500Fast 、 ViiA7, QuantStudio3/5/6Flex/7Flex, Stratagene MX4000/MX3005P/MX3000P。
不需要使用 ROX 的机型：Bio-Rad CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4; Cepheid SmartCycler; Eppendorf Mastercycler ep realplex, realplex 2 s; Illumina Eco qPCR; Qiagen/Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000; Roche Applied Science LightCycler 480; Thermo Scientific PikoReal Cycler。
3. qPCR反应程序，两步法PCR：
过程 | 温度 | 时间 |
预变性 | 95℃ | 3 min |
35-40 cycles | 变性 | 95℃ | 15 sec |
退火/延伸 | 60℃ | 10-30 sec |
熔解曲线分析，按仪器推荐程序 |
（注意：a.建议采用两步法 PCR 反应程序，若因使用 Tm 值较低的引物等原因，得不到良好的实验 结果时，可尝试进行三步法 PCR 扩增，退火温度请以 56℃-64℃的范围作为设定参考；b.融解曲线分 析请以所使用的荧光定量 PCR 仪推荐的程序进行设定。）
4. 反应结束后确认荧光定量 PCR 的扩增曲线和融解曲线，进行 PCR 定量时制作标 准曲线等。