一、 稀释标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。 由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能 污染样品或本试剂盒的其他成分。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不 提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。
1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同。
3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震 荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震 荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、 样品 DNA 的制备
7. 如果有 N 个样品待提取，最好设置 N+2 个提取，多出的是 PC（样品制备阳性对 照）和 NC（样品制备阴性对照）。可以取阳性对照的 10000 倍稀释液 10μL 再加 上一定量的水，使总体积与待提取样品的规定体积一致，以此作为 PC。另外用水作 为 NC。
8. 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼容。
三、 Probe qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上 步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6 个用于标准曲 线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，其中 N+2 个 用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用第 4 号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描 述操作步骤。
10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后 才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：
成分 | 样品管 N+2个 | PCR阴性对照管 | 标准曲线 样品管（2-7管） |
Probe qPCR Custom Mastermix | 10 μL | 10 μL | 各10 μL |
小鼠细小病毒qPCR探针 | 1μL | 1μL | 各1μL |
小鼠细小病毒探针法qPCR引物混合液 | 2μL | 2μL | 各2μL |
N+2 个待测 DNA 模板 | 7μL | - | - |
超纯水 | - | 7μL | - |
第 7 步所得标准曲线样品 稀释液 （2-7号） | - | - | 各7 μL（2号样到 2 号管，3 号样到 3 号管…） |
11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR：
过程 | 温度 | 时间 |
预变性 | 95℃ | 3 min |
PCR 反应 （40 个循环） | 95℃ | 15 sec |
60℃ | 1 min（采集 FAM 通道的荧光信号） |
四、 数据处理
12. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴， 绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值， 再推算出其浓度。
13. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。 阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 35。 对待测样品，如果其 Ct≥40 则为阴性，如果≤35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则 重复一次。若重复结果 Ct 值小于 40，扩增曲线有明显起降，该样本判断为阳性，否 则为阴性。